幕府在开国过程中的无能表现，也使日本各方看清了其色厉内荏的本质。外来贸易增加导致国内物价飞涨，平民和中下等武士深受其害，对幕府的不满越积越厚。农民和市民纷纷起义，中下层武士、商人和新兴地主中的改革势力也群起响应，借机开展倒幕运动。但是这些行动遭到了幕府的镇压。
1858年9月，幕府突然采取行动，大肆搜捕、迫害尊攘派领袖，制造了所谓“安政大狱”。尊王攘夷运动遭受沉重打击，并由此转入了低潮。这一事件让许多志士在充分认清了幕府的面目的同时，开始认真反思改革运动存在的一系列问题。
在安政大狱中被捕的吉田松阴就义时年仅29岁，他说：“今日之幕府、诸侯皆已为醉人，无扶持之术，非草莽崛起之人无所望矣。”在刑场上，他慷慨赋诗一首以明志：“吾今为国死，死不负亲君。悠悠天地事，鉴照在明神。”
很快，以樱田门之变为起点，倒幕斗争重新在全国如火如荼地蔓延起来。1860年3月24日清晨，偌大的江户城沉浸于霏霏细雪之中，水户藩和萨摩藩的18名浪人手持刀枪，悄悄来到樱田门外埋伏下来，准备刺杀幕府大佬井伊直弼。此人是守旧大名的代表，曾专断地决定同外国缔结条约等事情，而后又制造安政大狱，大肆逮捕他的反对派，致使100余人入狱，其中1/4被处死，大批大名和公卿被处分。